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故障排除

如何減少基線噪音

作者:技術部 來源:安恒達 瀏覽: 發布時間:2013-04-23 09:44

1. 流動相的在線混合.

所有的流動相在線混合都是從方便出發的結果, 流動相混合的不充分是基線噪音的一個重要來源。混合方式主要有兩種:

a. 低壓混合:采取時間脈沖的方式,利用比例閥,將不同流動相按一定比例混合。

b. 高壓混合:利用多個泵,控制每個泵的流量,將不同的流動相按一定比例混合。

在流動相混合后,一般都有一個混合器(Mixer)來幫助混合的更加充分。從流動相開始混合在一起,到流動相到達色譜柱頭,這一段體積叫做延遲體積(Delay Volume)。Mixer體積越大,混合越好,但是相應延遲體積就越大,造成梯度的延遲。換句話說,就是流動相的變化,需要一定時間后,才能真正到達色譜柱,對分離產生影響。

a. 這個現象在使用UPLC或者UHPLC的時候,會有比較明顯的作用。

b. 為什么相同梯度方法,在不同儀器,或者不同品牌的儀器之間轉化時,保留時間可能不一樣? 其主要原因就是延遲體積的不同。

在線混合很難做到非常均一的混合效果,這個在示差檢測器(RID)上的效果最明顯。這也是為什么示差檢測器都要求將流動相預混到一個瓶子里,不能走梯度的原因。

那如何減小因為混合而造成的基線噪音呢?

a. 對于等度的方法,非常簡單,預混流動相就可以了。

b. 對于梯度的方法,部分預混流動相也會幫助更好的混合,怎么做呢?看下面的例子。

方法要求乙腈/水比例從10%走到85%。 那可以將流動相A配成10%的乙腈,流動相B配成85%的乙腈,然后A/B梯度從0%走到100%。 這就是部分預混。

c. 增大Mixer的體積。一般mixer的體積從幾百ul到幾個ml都有,在允許的延遲時間下,更換一個體積更大的Mixer,能夠有效提高混合的效率。每個色生產廠家的Mixer體積都不一樣,基本都可以混用。

2.液相硬件問題造成的基線噪音。

   如果液相系統某些地方的工作不正常,也可能造成基線的噪音。

a. 系統有漏。特別是肉眼無法發現的微漏或者泵的內漏,會造成流速的變化和混合比例的變化,從而導致基線噪音。檢查的方法就是對系統進行壓力測試:將系統從某個地方用死堵堵上,如泵出口,或者自動進樣器出口,將壓力升高到350bar后停泵,監測壓力下降的情況。一般的標準是2-3bar/min的下降是正常水平。或者15%/10min的下降。

b. 梯度比例問題。可以對系統進行一個梯度測試,來檢查梯度混合是否準確和一致。將A配成0.1%的丙酮,B是水。在265nm的波長下,將A的比例10%,20%,30%這樣一個一個的升高,每個比例走3min。可以根據計算,看每個基線臺階上升是否準確。 也可以從0-100%走一個連續的梯度,看基線上升的平滑性和線性。

3.流動相脫氣不好造成的基線噪音。

對流動相進行脫氣,不僅僅是為了防止系統里面氣泡的產生。 流動相脫氣越好,基線就會越好。如今最常用的脫氣方式是在線脫氣機,但是有的時候脫氣并不徹底。所以當有基線噪音問題是,可以考慮采取多種的脫氣方式。

4.系統潔凈程度。

前面1-3點講的都是內在原因,造成的基線噪音或者波動。如果你前面的原因都找過了,問題還沒有解決,就得考慮一下是不是流動相里面是否有雜質了。如何檢查判斷是否為流動相的問題呢?

a. 每次更換一種流動相,看基線結果。

b. 重新配置所有流動相。這種方式比較快,但可能無法找到根本原因。

要特別注意在流動相的配置過程中,是否引入了污染,比如使用了不干凈的玻璃器皿什么的。更換溶劑的品牌和批次也是方法之一。

色譜柱長期使用造成的污染有時候也會造成基線波動。有些時候樣品里面可能有些保留非常強的組分,可能在色譜柱上很長時間才慢慢被沖出來,這時候已經不是一個峰了,而是基線的干擾或者波動了。

避免這種問題的方法:在每批樣品后,用甲醇或者已經長時間沖洗色譜柱。另外,專柱專用也是一個好的習慣。如果一根色譜柱上作很多不同的樣品,也可能導致互相之間的污染和影響。

5.電路的噪音。

對于UV檢測器來說,就是采樣頻率不合適而產生的噪音。現在隨著超高效液相的普及,檢測器的采樣頻率也越來越高,有的可以達到80Hz以上。但是如果一味追求高采樣頻率,可能對靈敏度沒有任何幫助,反倒產生比較大的噪音。一般來說,我們需要保證一個色譜峰上面有15-20個點,來保證比較平滑的峰形和比較準確的定量結果。如果我的一個峰的時間寬度是0.5min,就是是30s,那只要保證1Hz的采樣頻率就足夠了。如果在UPLC上面,一個峰的時間寬度是0.05min,也就是3s,就需要10Hz以上的采樣頻率。 那80Hz的采樣頻率什么時候用呢? 你的一個峰只有0.5s的時候。

理論上的計算是這樣的

N=16(T/W)^2

N是柱效。T是保留時間。W是峰寬。

一般色譜如果柱效12000的塔板數。在5min的時候,出峰寬度大概計算出來時11s。你可以根據計算結果來調整檢測器的合適的采樣頻率。



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